Kondroitin sülfat tayini için immünfloresan boyamalarda optimum fiksasyon yönteminin belirlenmesi

Authors : Duygu YÜCEL

Pages : 44-48

View : 18 | Download : 11

Publication Date : 2023-02-28

Article Type : Research Paper

Abstract :Amaç: Kondroitin sülfat insert ignore into journalissuearticles values(KS); zincirleri embriyonik hücre bölünmesi, sitokinez ve gelişimde rol oynayan, C. elegans’tan fareye benzer rollerde görev alan moleküllerdir. KS moleküllerinin fonksiyonları kurtçuktan memeli sistemlere kadar korunmuştur. Doku ve hücrelere mekanik destek veren, nöronal plastisite ve hücre migrasyonunda görev alan KS moleküllerinin biyosentezi, C. elegans’ta insandakine benzer bir mekanizma ile gerçekleştirilmektedir. 40 yılı aşkın geçmişi ile sağladığı kaynaklar ve ikisi Fizyoloji ve Tıp alanında, biri Kimya alanında olmak üzere C. elegans’ı kullanan bilim insanlarının aldığı Nobel ödülleri ile C. elegans model organizması insan moleküler biyolojisini anlamak için eşsiz bir platformdur. C. elegans ve insan arasında birçok biyolojik işlev korunmuştur. İnsan hastalık genlerinin % 65’ine C. elegans genomunda bir karşılık bulunabilmektedir. Bu çalışmada, C. elegans model organizmasında kondroitin sülfat moleküllerinin immünfloresan boyama tekniği ile gözlemlenmesi için en etkin fiksasyon yönteminin belirlenmesi hedeflenmiştir. Yöntem: İmmünfloresan boyamaların gerçekleştirilmesi için embriyolar, erişkin C. elegans ‘lardan izole edilmiş ve embriyo pelletleri %4 paraformaldehid insert ignore into journalissuearticles values(PFA); ve metanol ile fikse edilmek üzere iki farklı tüpe ayrıştırılmıştır. İnkübasyon ve yıkama aşamalarını takiben, örnekler, chondroitinase ABC insert ignore into journalissuearticles values(CSase ABC); enzimi ile muamele edilmiştir. Enzimin inaktive edilmesinin ardından %10 donkey serum ile bloke edilen embriyo pelletleri, primer antikor anti-chondroitin antibody insert ignore into journalissuearticles values(anti-proteoglycan ΔDi-0S antibody 1B5, 1:20; Seikagaku); ile gece boyu inkübe edilmiştir. Sekonder antikor olarak donkey anti-mouse Alexa 488 insert ignore into journalissuearticles values(Life Technologies); 1:250 oranında kullanılmış ve mikroskop preparatları hazırlanmıştır. Görüntüler inverted mikroskop kullanılarak elde edilmiştir. Bulgular: PFA ile yapılan boyamalarda, embriyonik katman yapılarının daha iyi korunduğu görülmüştür. Metanol ile fiksasyonun, embriyonik tabakaların yapısını bozduğu ve kondroitin boyamalarının başarısını düşürdüğü gözlemlenmiştir. Yapılan analiz ve karşılaştırmalarda, PFA ile yapılan fiksasyon aşamasının otofloresan sinyalini artırsa da, KS sinyalinin ve morfolojik yapısının tespiti için metanol ile yapılan fiksasyon yöntemine göre daha iyi sonuç verdiği gözlemlenmiştir. Sonuç: Bu çalışmada, KS tayini için en etkin yöntemin PFA fiksasyon yöntemi olduğu tespit edilmiştir. Böylece, PFA ile fiksasyon yöntemi kullanılarak, KS moleküllerine dair C. elegans model organizmasında fenotipik değişiklikler daha nitelikli ve yüksek doğrulukta analiz edilebilecektir.
Keywords : Kondroitin sülfat, fiksasyon yöntemi, C elegans, immünfloresan boyama, ekstraselüler matriks