Escherichia coli Ekspresyon Plazmiti pTolT’nin Nokta Mutasyonu Yöntemiyle Moleküler Modifikasyonu

Authors : Yakup ULUSU

Pages : 1-8

View : 25 | Download : 13

Publication Date : 2019-12-31

Article Type : Research Paper

Abstract :Bakteriler rekombinant protein üretimi için kolay kültür edilmeleri, basit yapıları ve genetik manipülasyonlara açık olmaları nedeniyle en çok tercih edilen konakçılardandır. Özellikle Escherichia coli en yaygın olarak kullanılan prokaryotik konakçı olarak pek çok araştırmada karşımıza çıkmaktadır. Tüm bu avantajlarının yanında, yabancı proteinlerin yüksek miktardaki üretimleri, Escherichia coli’de inklüzyon cisimciklerinin oluşmasına veya toksik etkilere neden olabilmektedir. Bu problemlerin aşılması amacıyla geliştirilen pTolT ekspresyon vektörü heterolog proteinlerin Escherichia coli periplazmik bölge proteini TolAIII ile birlikte üretilmesine imkân sağlamaktadır. Bununla birlikte TolAIII proteininde 31 ve 56. pozisyonda bulunan sisteinler bu sistemle üretilen diğer proteinler ile istenmeyen disülfit köprüleri kurarak rekombinant proteinin aktivitesi üzerine etki etmektedir. Bu çalışmanın amacı TolAIII proteininde bulunan sisteinlerin kaldırılarak yerine serin amino asitlerinin getirilmesidir. In vitro nokta mutasyonu tekniği, gen klonlama ve ekspresyon stratejilerinin düzenlenmesi amacıyla vektör DNA dizilerinin modifiye edilmesinde, protein yapı ve fonksiyon çalışmalarında ve genetik araştırmalarda sıklıkla kullanılan gelişmiş bir tekniktir. Bu teknikte mutajenik primerler vasıtasıyla polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) işlemi ile kalıp plazmid DNA’nın birçok yeni kopyasını meydana getirilir. Sunulan çalışmada QuikChange site-directed mutagenesis metoduyla TolAIII gen dizisinde C31S ve C56S mutasyonları gerçekleştirilmiştir. DNA sekans analizi sonuçları ile teyit edilen mutasyonun ardından elde edilen yeni plazmid pTolT Delta olarak adlandırılmıştır. Böylece bu çalışma ile geliştirilen yeni ekspresyon sistemi ile üretilecek rekombinant proteinlerin doğal üç boyutlu konformasyonlarını kazanmaları daha kolay olacaktır.
Keywords : pTolT, Nokta Mutasyonu, esherichia coli, rekombinant protein