Extracellular Production and Purification of the β-glucanase in Pichia pastoris Expression System

Authors : Mert KARAOGLAN, Fidan ERDEN KARAOĞLAN

Pages : 620-630

Doi:10.18185/erzifbed.972627

View : 14 | Download : 11

Publication Date : 2021-08-31

Article Type : Research Paper

Abstract :Bu çalışmada, Rhizomucor miehei -1,3-1,4-glukanaz geni, Pichia pastoris ekspresyon sisteminde AOX1 promotorunun regülasyonu altında ifade edilmiş ve en yüksek üretim seviyesini sağlayan klon belirlenmiştir. Kodon optimize edilmiş gen, pPICZA ekspresyon vektörüne bağlanmış ve kompetent P. pastoris KM71H hücrelerine aktarılmıştır. Farklı konsantrasyonlarda zeosin içeren plakalardan otuz transformant seçilerek klonlar protein üretimi için test tüplerinde kültüre alınmıştır. Süpernatant örneklerinde glukanaz enzim aktivitesi ölçülmüş ve en yüksek glukanaz aktivitesi gösteren on klon belirlenmiştir. Ayrıca süpernatant örneklerindeki proteinler SDS-PAGE ile analiz edilmiş ve glukanaz enzimi, yaklaşık 34 ve 38 kDa olmak üzere 2 bant halinde gözlenmiştir. En yüksek glukanaz enzim üretimine sahip klon ile 200 mL indüksiyon ortamında (BMMY) 72 saat boyunca protein üretimi gerçekleştirilmiş ve rekombinant glukanaz enzimi Ni-NTA afinite kromatografisi ile saflaştırılmıştır. Saflaştırma işleminden sonra analiz edilen klonun 79,6 mg/L glukanaz üretim seviyesine ulaştığı belirlenmiştir. Saflaştırma işleminin her aşamasından alınan örneklerin SDS-PAGE analizi, süpernatant örneklerinde de gözlenmiş olan iki protein bandının glukanaz enzimini temsil ettiğini göstermiştir.
Keywords : B glukanaz, pichia pastoris, rhizomucor miehei, protein saflaştırma