Applications of Different Comet Assay (the Single Cell Gel Eelectrophoresis) Methods for Detecting DNA Damage in Cryopreserved Fish Sperm

Authors : Burak Evren İnanan, Nazlı Yıldırım, Ekin Demirkaya

Pages : 6-13

View : 37 | Download : 7

Publication Date : 2016-12-11

Article Type : Research Paper

Abstract :Kriyoprezervasyon, hem insan hem de hayvan gametlerinin, hatta embriyolarının, başarılı bir şekilde uzun süreli saklanması için yaygın olarak kullanılan yardımcı üreme tekniklerindendir. Ayrıca, sperm kriyoprezervasyonun birçok avantajı vardır. Örneğin, balıklarda suni döllemenin geliştirilmesinde, genetik manipülasyonların kolaylaştırılmasında, erkek anaç stokunun azaltılmasında kullanılır. Ancak kriyoprezervasyon sonrası, sperm hücrelerinde sonrasında dölleme ve yumurtadan çıkış oranlarının azalmasına sebep olacak motilite kaybı ve DNA hasarı gibi problemler ile oluşabilir. Comet analizi, DNA sarmalındaki kırıkları tek bir sperm hücresi seviyesinde tespit edebilen basit ve hassas bir araçtır.  Bu çalışmada, farklı kimyasal maddeler ve uygulama zamanlarına sahip üç farklı Comet analiz metodu balık sperm hücrelerine uygulanmıştır. Olgun sazan balığı insert ignore into journalissuearticles values(Cyprinus carpio);  bireylerinden alınan sperm örnekleri bu çalışmada kullanılmıştır. Öncelikle, taze sperm örnekleri kullanılarak, her metot için liziz solüsyonuna 12, 25 ve 50 µM H 2 O 2 eklenerek DNA hasarı sınıflandırılmıştır. Böylece, DNA hasarı, her hücre DNA’sının oluşturduğu kuyruk uzunluğuna göre floresan mikroskop altında incelenerek görsel olarak, 1. 2. ve 3. dereceden hasarlı ve H 2 O 2 eklenmemiş örnekler 0 insert ignore into journalissuearticles values(hasarsız); olarak ölçeklendirilebilir. Sonrasında,   kriyoprezervasyon uygulanmış sperm örnekleri çözündürülerek, üç farklı Comet analiz metodu uygulanmıştır. Üç metoda ait yüzde hasarsız DNA sonuçları insert ignore into journalissuearticles values(%67,7±2,0; % 69,3±1,8 ve %68,2±2,8);   arasında ve toplam hasarlı DNA sonuçları insert ignore into journalissuearticles values(%32,3±2,0; % 30,7±1,8 ve %31,8±2,8); arasında istatistiki olarak önemli derece fark saptanamamıştır. Buna karşın, DNA hasar sınıflandırmaları arasında bazı istatistiksel farklılıklar bulunmaktadır. Sonuç olarak, her üç metot hasarsız ve toplam hasarlı DNA tespitinde benzer başarıyı göstermekte iken DNA hasar sınıflarının tanımlanmasında farklılıklar olabilmektedir.
Keywords : Kriyoprezervasyon, COmet Analizi, DNA Hasarı, Balık Spermi, Tek Hücre Jel Elektroforezi

ORIGINAL ARTICLE URL