Tek Basamaklı Ters Transkripsiyon Kantitatif PZR Yönteminin miRNA Ekspresyon Analizleri için Optimizasyonu

Authors : Seda SÜSGÜN, İlker KARACAN, Emrah YÜCESAN

Pages : 113-119

Doi:10.26650/experimed.2021.948146

View : 51 | Download : 7

Publication Date : 2021-08-25

Article Type : Research Paper

Abstract :Amaç: Bu çalışmada mikroRNA insert ignore into journalissuearticles values(miRNA); hedeflerinin spesifik ola-rak belirlenmesi ve ekspresyon ölçümünün yapılmasına yönelik tek basamaklı ters transkripsiyon kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu insert ignore into journalissuearticles values(RT-qPZR); yönteminin, seçilen iki farklı miRNA insert ignore into journalissuearticles values(hsa-miR-145-5p ve hsa-miR-146a-5p); için araştırılması ve sürecin optimizasyonu amaçlanmıştır. Gereç ve Yöntem: RNA eldesi HEK293T hücre hattından yapılmıştır. Çalışmada seçilen her iki miRNA hedefi için uygun primerler tasarlanmış, tek basamaklı RT-qPZR yöntemi ile optimizasyon işlemi gerçekleştirilmiştir. Hedef amplikonların spesifiklik doğrulamaları agaroz jel elektroforezi ve konvansiyonel dizileme yöntemi ile gerçekleştirilmiştir. Bulgular: Tek basamakta gerçekleştirilen RT-qPZR çalışmasının her iki primer için de yüksek spesifiklikte ve hassasiyette sonuç verdiği qPZR erime eğrisi analizi ve agaroz jel görüntüleme sistemi ile gös-terilmiştir. qPZR sırasındaki bağlanma sıcaklıklarından en düşük Ct değerinin 54°C’de elde edildiği görülmüştür. Ayrıca konvansiyonel Sanger dizileme sonucunda yalnızca ilgili miRNA dizilerinin hedef-lendiği ve spesifik olmayan herhangi bir çoğaltma işleminin olmadığı gösterilmiştir. Sonuç: Sunulan çalışmada deneysel tasarım her iki miRNA hedefi için de optimize edilerek spesifik olarak yalnızca hedef miRNA mo-lekülünün tespitinin yapılabildiği gösterilmiştir. Bu yaklaşım, ilerleyen çalışmalarda miRNA tespit ve ekspresyon analizlerinde güvenilir olarak kullanılabilecektir. Sunulan yaklaşım, düşük maliyetli, zamandan ve iş gücünden tasarruf sağlayan bir alternatif olması sebebiyle benzer tüm çalışmalarda değerlendirilebilir.
Keywords : miRNA, RT qPZR, miR 145, miR 146a

ORIGINAL ARTICLE URL